Recept RNA

Het is champagne voor iedereen. Phil Zamore laat de kurk uit een fles Montaudon vallen en het gloednieuwe tapijt doordrenkt. Iedereen in zijn lab vult een glas om te proosten op de baas. Onverwacht goed nieuws, legt hij uit. Zamore, een biochemicus aan de University of Massachusetts Medical School in Worcester, heeft zojuist een nationale prijs van $ 1 miljoen ontvangen over een periode van vijf jaar. Het budget van het lab is net verdrievoudigd.

Zamore is begrijpelijkerwijs duizelig, en het gaat niet alleen om het geld. Zamore's veld, RNA-interferentie, of RNAi, is nog maar een paar jaar oud, maar heeft de wereld van de biologie stormenderhand veroverd. RNAi is het meest opwindende inzicht in de biologie in de afgelopen tien jaar of twee, zegt Nobelprijswinnaar Phillip Sharp, een bioloog aan het MIT. En het laboratorium van Zamore is een van de weinige die het veld in een duizelingwekkend tempo vooruit beweegt. Ik denk dat iedereen die in het veld werkt een beetje buiten adem is van de vooruitgang, zegt Zamore.

Dit verhaal maakte deel uit van ons nummer van december 2002

• Zie de rest van het nummer
• Abonneren

Het gevoel van opwinding dat door Zamore, Sharp en andere onderzoekers wordt gedeeld, is gegrond. Decennia lang dachten onderzoekers dat RNA slechts de boodschapper van DNA was, die slaafs de eiwitblauwdrukken van DNA afleverde. Maar nu blijkt dat kleine dubbele RNA-strengen, geïntroduceerd in in het laboratorium gekweekte cellen of dieren, een bepaald gen snel en efficiënt kunnen uitschakelen.

De implicaties zijn adembenemend, omdat levende organismen grotendeels worden bepaald door het prachtig georkestreerde aan- en uitzetten van genen. Biologen hebben dit omschakelingsproces tot nu toe alleen op een langzame, logge en indirecte manier kunnen nabootsen. Maar het gemak waarmee RNAi genen kan uitschakelen, zeggen onderzoekers, lijkt bijna mystiek. Laboratoriumtechnieken die RNAi gebruiken, zijn nu al de favoriete methoden van biologen om de functies van bepaalde genen te ontdekken. En het belooft een nieuwe manier om ziekten direct te behandelen door sleutelgenen die betrokken zijn bij verschillende kwalen uit te schakelen. Al minstens acht bedrijven - waaronder één opgericht door Zamore, Sharp en collega's - werken aan RNAi-therapieën voor alles van virale ziekten tot kanker.

De Heilige Graal is om dit alles te ontwikkelen tot drugs, zegt Zamore. Om u een klein storend RNA te kunnen geven dat de expressie van uw hoog-cholesterolgen zou uitschakelen. Dat zou het niveau van hepatitis C dat uw lever infecteert, verlagen. Of misschien, denk ik, in misschien wel de grootste taart-in-de-lucht-toepassing, die een gen zou aanscherpen dat specifiek is voor tumorcellen en de tumor zou doden.

Hoe snel dit kan gebeuren, is een gok. RNA-interferentie brak het bewustzijn van de wetenschappelijke wereld binnen tijdens de jaarlijkse bijeenkomst van de RNA Society in Banff, Alberta, in mei 2001. Daar was Sayda Elbashir, een postdoc in het laboratorium van biochemicus Thomas Tuschl van het Max Planck Institute for Biophysical Chemistry in Gttingen, Duitsland, verbaasde zijn luisteraars met het nieuws dat kleine dubbelstrengs RNA-fragmenten snel, gemakkelijk en specifiek genen in menselijke cellen uitschakelden, een rol die onderzoekers nog nooit eerder hadden gezien dat RNA speelde.

Het grootste deel van het publiek zat daar maar tegen zichzelf te zeggen: de wetenschap is gewoon veranderd', herinnert de biochemicus David Engelke van de Universiteit van Michigan zich. Het enige dat pandemonium voorkwam, was dat ons dit soort dingen eerder was beloofd. Sceptisch wachtte Engelke een paar maanden. Toen begonnen deze meldingen binnen te druppelen: Goh, dit werkt echt!’

De RNA-verrassing

Tot voor kort was de nogal onaantrekkelijke rol die biologen aan RNA toeschreven, die van een passieve boodschapper, die genetische informatie van DNA afleverde aan de eiwitproducerende machinerie van de cel. In dit proces wordt de DNA-code van een gen getranscribeerd in een RNA-kopie, die de cellulaire machinerie vertaalt in een eiwit. Bij RNA-interferentie blokkeren korte stukjes RNA het proces door het bericht onderweg te vernietigen. De dubbelstrengs RNA-fragmenten leiden snij-enzymen naar het RNA dat de genetische boodschap draagt. Het boodschapper-RNA wordt vervolgens in stukjes gehakt en gemarkeerd voor vernietiging: de boodschap van het gen wordt effectief het zwijgen opgelegd.

Biologen weten al jaren dat enkelstrengs RNA-moleculen die zijn ontworpen om te paren met een boodschapper-RNA de eiwitproductie kunnen stopzetten, maar dit kunstmatige proces is zelfs in het laboratorium onbetrouwbaar. De natuur reguleert genen echter met behulp van RNA, met name dubbelstrengs moleculen.

De eerste hints van het fenomeen verschenen in 1990, maar in die tijd brachten onderzoekers wat ze hadden waargenomen niet in verband met RNA. Dat jaar probeerde plantbioloog Rich Jorgensen, toen bij DNA Plant Technology in Oakland, CA, paarse petunia's een diepere tint paars te maken. Hij plaatste een nieuwe, supercharged kopie van het gen dat de productie van paars pigment regelt. Tot zijn verbazing kreeg hij witte petunia's. Jorgensen erkende het belang van dit paradoxale effect, maar hij kon niet verklaren waarom het toevoegen van meer van een gen dat gen had uitgeschakeld.

De volgende aanwijzing kwam in 1995, toen genetici van de Cornell University een gen klonen in de microscopisch kleine bodemworm C. elegans . Om hun ontdekking te verifiëren, gebruikten ze een standaard laboratoriummethode om het gen uit te schakelen: ze voegden een enkele streng RNA toe die overeenkwam met het boodschapper-RNA. Deze complementaire streng bindt zich aan de boodschapper, waardoor deze niet wordt vertaald in een eiwit. Onverwacht sloot een niet-complementaire enkele streng RNA die ze gebruikten als experimentele controle en die niets had moeten doen, ook het gen af.

In 1998 losten biochemicus Andrew Fire, toen aan de Carnegie Institution of Washington, en geneticus Craig Mello, aan de University of Massachusetts Medical School, het mysterie op. Door complementaire enkele strengen RNA in wormen te injecteren, kregen ze een verbazingwekkend krachtig silencing-effect wanneer de twee strengen werden gecombineerd. Nadat ze hadden aangetoond dat dubbelstrengs RNA het echte silencingmiddel was, bedachten Fire en Mello de term RNA-interferentie, en een nieuw veld was geboren. Achteraf bekeken leverden Jorgensens supercharged paarse genen dubbelstrengs RNA's op die hetzelfde effect hadden op de inheemse paarse genen, waardoor ze in wezen werden uitgeschakeld.

Het dubbelstrengs RNA leek een stabieler en betrouwbaarder middel te bieden voor het afsluiten van specifieke genen dan de enkelstrengs, en laboratoria die organismen bestudeerden, waaronder planten, wormen en vliegen, namen de nieuwe methode gretig over. RNA-interferentie werkte echter niet bij zoogdieren: het immuunsysteem vernietigt cellen die dubbelstrengs RNA bevatten om zich te verdedigen tegen RNA-virussen zoals die welke hepatitis A en C veroorzaken. Toen kwam Tuschl en Elbashir's onthulling in Banff dat zeer korte RNA-segmenten, die ze klein storend RNA noemden, werkte wel in menselijke cellen. Op dat moment, zegt Sharp, ging het hele veld van start.

Stille behandeling

Nu zoeken onderzoekers naar manieren om deze krachtige nieuwe rol voor RNA om te zetten in bedrijfswinsten. Vrijwel alle farmaceutische bedrijven gebruiken al RNA-interferentie als een hulpmiddel voor het ontdekken van geneesmiddelen. Een van de meest populaire strategieën om nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen te vinden, is het één voor één uitschakelen of uitschakelen van genen om te zien wat er gebeurt. Als een ziek dier bijvoorbeeld kan worden genezen door een bepaald gen uit te schakelen, kan het eiwit van dat gen een goed medicijndoelwit zijn. Het blijkt dat het gebruik van kleine interfererende RNA's dit proces radicaal kan versnellen. In plaats van maanden of jaren te besteden aan het maken van een knock-out, gebruiken onderzoekers de RNA's om specifiek en snel een gen uit te schakelen. Ze kunnen ook observeren of het uitschakelen van het eiwit - als medicijn - bijwerkingen veroorzaakt. Het proces vindt plaats in een kwestie van dagen in plaats van een jaar, zegt Christophe Echeverri, CEO van Cenix BioScience, een biotechbedrijf in Dresden, Duitsland.

In de uiteindelijke toepassing kunnen kleine interfererende RNA's zelf medicijnen zijn: in plaats van een bepaald eiwit te blokkeren, zoals standaard medicijnen doen, zou RNAi voorkomen dat het eiwit ooit wordt gemaakt. Afgelopen juni toonde Sharp van MIT aan dat dergelijke RNA's, gericht op de belangrijkste virale en menselijke genen, hiv-infectie in cellen die in het laboratorium zijn gekweekt, kunnen stoppen. In één experiment mengden de onderzoekers HIV-geïnfecteerde cellen met kleine storende RNA's gericht op virale genen. De RNA's stopten de virale reproductie. Sharp's groep mengde ook niet-geïnfecteerde cellen met kleine interfererende RNA's gericht op CD4, een eiwit op het oppervlak van cellen waardoor HIV toegang krijgt. De onderzoekers toonden aan dat de RNA's de productie van CD4 wel verminderden. Twee en een halve dag later stelden ze RNA-behandelde cellen en onbehandelde cellen bloot aan HIV. Het virus infecteerde vier keer zoveel onbehandelde cellen.

Ondanks de bemoedigende resultaten, bevinden RNAi-medicijnen zich voorlopig nog in de droomfase, zegt Sharp. Maar Sharp vond de vroege belofte verleidelijk genoeg om samen met Zamore, Tuschl en twee andere wetenschappers Alnylam Pharmaceuticals in Cambridge, MA, op te richten om dergelijke medicijnen te ontwikkelen. Het bedrijf was amper van de grond toen het afgelopen juli $ 17 miljoen aan durfkapitaalfinanciering binnenhaalde.

Het maken van RNAi-medicijnen zal echter niet eenvoudig zijn. Om te beginnen heeft niemand methoden gevonden die geschikt zijn om de RNA's aan mensen toe te dienen. Er is een leveringsprobleem. Zo simpel is het, zegt chemicus Stuart Schreiber van Harvard University. Nucleïnezuren naar hun doelweefsels krijgen [is] een onopgelost probleem in de geneeskunde. RNAi-therapie is in wezen gentherapie, zegt Schreiber, en het zal met dezelfde problemen worden geconfronteerd - inefficiëntie, ineffectiviteit en immunologische bijwerkingen - die dat veld tot stilstand hebben gebracht sinds 1999, toen Jesse Gelsinger stierf tijdens een gentherapie-proef aan de Universiteit van Pennsylvania. Artsen daar gebruikten gemodificeerde virussen als transportmiddelen, of vectoren, om DNA in de cellen van de tiener te brengen. Het immuunsysteem van Gelsinger reageerde massaal en dodelijk.

Sharp zegt dat de hoop is dat klein interfererend RNA mogelijk geen vectoren nodig heeft om zijn doel te bereiken, waardoor de meeste valkuilen worden vermeden die samenhangen met op DNA gebaseerde gentherapie. Maar dat scenario is verre van zeker. Kun je RNA's aanpassen om ze stabieler te maken [en] zodat ze efficiënter door cellen worden opgenomen? vraagt ​​Scherp. We weten het niet.

Zinvol

De recente biomedische geschiedenis helpt niet om de onzekerheid weg te nemen. In feite is dit niet de eerste keer dat wetenschappers hebben geprobeerd een medicijn te maken op basis van RNA tot zwijgen brengen. Enkelstrengs antisense RNA of DNA kan ook genen afsluiten en heeft geen vector nodig. In de cel vindt een antisense-molecuul zijn complementaire boodschapper-RNA en, als twee kanten van een ritssluiting, binden ze stevig, waardoor het boodschapper-RNA niet door de eiwitmakende machinerie van de cel kan gaan. Het resultaat, althans in theorie, is genuitschakeling.

Antisense is echter tot nu toe een teleurstelling geweest als basis voor nieuwe medicijnen. Na meer dan tien jaar intensief ontwikkelingswerk heeft slechts één antisense-medicijn - Vitravene van Isis Pharmaceuticals, voor de behandeling van bepaalde zeldzame ooginfecties bij AIDS-patiënten - de goedkeuring van de Food and Drug Administration gewonnen. De eerste generatie antisense-geneesmiddelen, die in het begin van de jaren negentig werden getest, werden snel afgebroken in het lichaam, waren moeilijk in de cellen te krijgen, slaagden er vaak niet in hun doelwit te vinden en veroorzaakten ernstige bijwerkingen. Stabielere antisense-geneesmiddelen worden nu op mensen getest.

Kan RNAi het beter doen dan antisense? Niet snel, voorspelt Frank Bennett, vice-president voor antisense-onderzoek bij Isis. Als je RNAi vergelijkt met de huidige versie van antisense, is er echt geen voordeel, zegt hij. [Kleine storende] RNA-technologie staat echt nog in de kinderschoenen. Het is enigszins gelijk aan waar antisense 10 jaar geleden was, toen we net begonnen met het doen van experimenten op dieren.

Maar RNAi-mensen zien hun technologie als fundamenteel anders dan antisense. Het grote voordeel van RNAi ten opzichte van antisense is dat dit echt werkt, zegt Echeverri, CEO van Cenix. RNAi, zegt hij, is veel krachtiger en betrouwbaarder dan antisense. Antisense-projecten werden doorgaans gezien als zelfmoordprojecten, zegt hij. Je zou er veel tijd aan kunnen besteden om het werkend te krijgen, en het zou nooit werken. Je zou niets meer hebben om te laten zien. De grotere potentie van RNAi, meent Echeverri, zou betere therapieën moeten opleveren. En omdat er minder medicijnen nodig zijn om een ​​gen tot zwijgen te brengen, zouden er minder bijwerkingen moeten zijn.

Mensen worstelen met antisense, en hier is een technologie die echt werkt, beaamt Jon Wolff, Chief Scientific Officer van Mirus, een RNA-therapeutisch bedrijf in Madison, WI. Antisense is moeilijk te reproduceren, maar RNAi is iets dat direct uit het vat werkt.

Maar zou RNAi gewoon weer een overhyped technologie kunnen zijn? Het bewijs zit in de pudding, zegt Echeverri. In de afgelopen twee, drie jaar heeft RNAi het net volledig overgenomen. Iedereen wendt zich ernaar; in elk organisme proberen ze het. En het zou niet zo populair zijn als het niet succesvol was.

Twijfels het zwijgen opleggen

Niemand heeft RNAi nog bij mensen geprobeerd, maar één bedrijf is dichtbij: Ribopharma, een biotech-startup in Kulmbach, Duitsland. Meer dan een jaar voordat de groep van Tuschl de wetenschappelijke gemeenschap verblufte met hun nieuws, ontdekten de oprichters van Ribopharma, voormalig Bayreuth University-docenten Roland Kreutzer en Stefan Limmer, dat kleine RNA's in zoogdiercellen werkten. Of dat beweren Kreutzer en Limmer. Ze hebben hun gegevens nooit gepubliceerd.

Kreutzer en Limmer redeneerden dat het fysiek onmogelijk was voor de zeer lange RNA's, zoals die gebruikt door Fire en Mello, om allemaal tegelijk aan hun doel-RNA's te binden. Alleen korte segmenten zouden blijven plakken. Dus probeerden ze zoogdiergenen tot zwijgen te brengen met behulp van RNA's die kort genoeg waren om de fatale immuunrespons te omzeilen. Het was gokken, zegt Limmer. En het bleek echt te werken. De onderzoekers dienden een octrooiaanvraag in, zegden hun baan in het onderwijs op en richtten in juni 2000 Ribopharma op.

De directeuren van Ribopharma zijn van plan om volgend jaar met proeven op mensen te beginnen, waarschijnlijk met tests van kleine interfererende RNA's bij de behandeling van kwaadaardig melanoom en pancreaskanker. Kreutzer en Limmer zeggen dat hun RNA-constructen stabiel genoeg zijn om zonder vectoren te werken en direct in de plaats van een tumor of in de bloedbaan kunnen worden geïnjecteerd. Het bedrijf heeft meer dan $ 18 miljoen opgehaald. Maar omdat Ribopharma zijn resultaten nog moet publiceren, is het moeilijk om zijn beweringen te evalueren, zeggen andere RNA-onderzoekers. Ze hebben een aantal dingen gedaan, zegt Sharp van MIT, best aardig ... [Maar] het is een lange weg.

Hoe lang? De houdingen variëren van de optimistische verzekeringen van Ribopharma tot sterk pessimisme. David Beach, president van RNAi-startup Genetica in Cambridge, MA, wijst op de tien jaar durende odyssee van antisense. Ik wil niet gaan zitten en argumenteren dat het inzetten van RNAi in een therapeutische modus eenvoudiger zou zijn, zegt hij.

Wat veel duidelijker is, is dat RNAi biologen dwingt om de rol van RNA te heroverwegen. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers honderden genen gevonden die coderen voor kleine RNA-moleculen, microRNA's genaamd, in organismen variërend van planten en wormen tot mensen. Net als hun kleine interfererende RNA-neven, lijken microRNA's genen tot zwijgen te brengen, maar hun rol in de biologie is grotendeels onbekend. Velen van hen zijn zeer sterk geconserveerd in de loop van de evolutie; [dus] ze moeten iets belangrijks doen, zegt MIT-bioloog David Bartel. Ondertussen heeft het besef dat RNAi een natuurlijk en waarschijnlijk fundamenteel proces is in planten en dieren ertoe bijgedragen dat het een van de meest opwindende mysteries in de hedendaagse biologie is geworden.

Kleine RNA-genen zijn misschien het biologische equivalent van donkere materie - overal om ons heen, maar ontsnappen bijna aan detectie, schreef Gary Ruvkun, een moleculair bioloog van de Harvard Medical School, in 2001 in het tijdschrift Wetenschap . Wat doen deze mysterieuze genen? Ik vermoed dat we naar een zeer oude methode kijken om genexpressie te controleren, zegt Zamore.

Als microRNA's schakelaars zijn die beslissen of stamcellen neuronen of spieren worden, of kankercellen groeien of afsterven, dan is RNA-interferentie veel belangrijker dan iemand zich een paar jaar geleden kon voorstellen. We stuitten gewoon op een hele nieuwe tak van moleculaire biologie die we nog niet kenden, zegt Engelke uit Michigan.

Voor de optimisten voorspellen deze doorbraken de snelle ontwikkeling van effectieve medicijnen. En zelfs biomedische onderzoekers die cynisch werden door extravagante claims voor magische genezingen, denken dat RNAi misschien wel het echte werk is. Vorig jaar, toen RNAi voor het eerst in menselijke cellen werkte, werd iedereen wakker en zei: ik vraag me af of dit de zilveren kogel is?', zegt Engelke. En dat is misschien ook zo. Het kan zijn.

Bedrijven die RNA-interferentie ontwikkelen BEDRIJF PRIMAIRE RNAi FOCUS Alnylam Pharmaceuticals
(Cambridge, Massachusetts)
Therapeutica Benitec
(Brisbane, Australië)
Intellectuele eigendom voor genomica en therapie Cenix BioScience
(Dresden, Duitsland)
Identificatie van geneesmiddeldoelen en therapieën voor kanker Devgen
(Gent, België) Identificatie van geneesmiddeldoelen en therapieën voor diabetes, depressie en de ziekte van Parkinson Genetica
(Cambridge, Massachusetts)
Identificatie van geneesmiddeldoelen voor kanker Mirus
(Madison, Wisconsin)
Therapeutica, met behulp van lang dubbelstrengs RNA ribofarma
(Kulmbach, Duitsland) Therapeutica voor kanker en hepatitis C

zich verstoppen