Sequentie in een flits

Op 6 februari 2007 lieten executives van 454 Life Sciences de 78-jarige James Watson een eerste versie van zijn eigen genoom zien. Dit had iets ronduit poëtisch. Watson had natuurlijk 45 jaar eerder een Nobelprijs gewonnen voor zijn rol bij het ontdekken van de dubbel-helixstructuur van DNA; hij was ook een drijvende kracht achter het Human Genome Project, dat bij de voltooiing in 2003 in 13 jaar bijna $ 3 miljard had besteed aan het extraheren van de blauwdruk die deze helices coderen. Nu was 454 een stap verder gegaan dan dat megaproject, dat het DNA van veel mensen samenbracht om de genetische volgorde te bepalen van wat neerkomt op een modelmens. Het bedrijf en zijn zogenaamde next-generation sequencing-machine hadden in zijn eentje de genetische code gelezen van een persoon - iemand wiens werk zoveel had gedaan om de prestatie mogelijk te maken.

Jonathan Rothberg van 454 gelooft dat zijn machines sequencing zo goedkoop en snel zullen maken dat het praktisch zal worden om de genomen van individuen te lezen.

Maar Jonathan Rothberg, die 454 oprichtte in Branford, CT, met de droom om een ​​sequencing-machine te produceren die efficiënter is dan de machines die beschikbaar zijn voor het Human Genome Project, noemt poëzie niet wanneer hij vertelt over zijn ontmoeting met Watson. Hij heeft het eerder over geld, snelheid en een toekomst waarin gewone mensen hun persoonlijke genoom op schijven met zich meedragen - een scenario dat steeds aannemelijker wordt. Het kostte ons $ 200.000 om Jim Watson te doen, zegt Rothberg. En dat deden we meestal in december en januari.

Dit verhaal maakte deel uit van ons nummer van mei 2007

• Zie de rest van het probleem
• Abonneren

Rothberg, die nu de raad van bestuur van 454 voorzit, benadrukt dat Project Jim een ​​werk in uitvoering blijft en meer tijd en geld zal vergen. In februari had het bedrijf het DNA van Watson slechts drie keer gesequenced (elke run verhoogde de nauwkeurigheid en vulde gaten); negen passages waren nodig om de definitieve conceptreeks van het Human Genome Project te produceren. Maar nog steeds.

Het bedrijf van Rothberg is slechts een van de vele, waaronder Illumina uit San Diego en Applied Biosystems uit Foster City, CA, die machines ontwikkelen die DNA sneller dan ooit tevoren kunnen decoderen. En net zoals de kosten van computerkracht zijn gedaald met de gestaag toenemende dichtheid van transistors op chips, is de prijs van DNA-sequentiebepaling snel gedaald met de komst van deze machines. Tegenwoordig zou het prijskaartje van een menselijk genoom, gedecodeerd met sequencers van het type dat in het Human Genome Project wordt gebruikt, $ 25 miljoen tot $ 50 miljoen bedragen. Het daalt tot ongeveer $ 1 miljoen met machines van de volgende generatie die vandaag beschikbaar zijn en zou tegen 2008 zo laag kunnen zijn als $ 100.000.

Multimedia

• Bekijk een afbeelding van de geheimen van sequencing.

Zoals de geschiedenis van computers heeft aangetoond, kan meer rekenkracht voor minder geld leiden tot onverwachte toepassingen. In het kielzog van het Human Genome Project stonden onderzoekers voor moeilijke financiële beslissingen over de volgende genomen: chimpansee of makaak, koe of dolfijn, rijst of cassave. De nieuwe machines maken het mogelijk om bijna alles van belang te rangschikken. En naarmate steeds meer sequentiegegevens in databases stromen, openen zich hele nieuwe onderzoeksgebieden. Wetenschappers hebben nu een ongekend vermogen om vergelijkingen tussen soorten te maken en licht te werpen op alles, van evolutionaire vragen tot genetische redenen voor individuele verschillen in ziekteresistentie en gevoeligheid. Onderzoek gedaan met de machines van 454 en gepubliceerd in toptijdschriften omvat de gedeeltelijke sequentiebepaling van een Neanderthaler-genoom en de ontwikkeling van nieuwe tests voor kankerverwekkende genetische mutaties - technologie die artsen kan helpen behandelingen op hun patiënten af ​​te stemmen.

Het afgelopen jaar was de meest opwindende periode in de genomica sinds de dagen van het Human Genome Project, zegt Eric Lander, eerste auteur van de eerste gepubliceerde versie van het menselijk genoom van het project en nu hoofd van het Broad Institute for genomic medicine in Cambridge, MA . Sequencing wordt goedkoop genoeg en krachtig genoeg om op zowat elk probleem te kunnen worden toegepast. Hij staat het veld op zijn kop. Francis Collins, die het Human Genome Project voor de National Institutes of Health leidde, voorspelt dat de nieuwe sequencing-technologieën ingrijpende gevolgen zullen hebben voor de toekomst van biomedisch onderzoek en, uiteindelijk, voor de praktijk van de geneeskunde.

Een unieke oplossing
Het kantoor van Jonathan Rothberg heeft een dinerthema, met een rood-zwarte schaakbordtegelvloer, met rode Naugahyde bedekte chromen stoelen en een bank met armen die de achterkant van een Cadillac uit 1959 imiteren, compleet met monsterlijke staartvinnen en kogelvormige achterlichten . In plaats van een bureau heeft hij een eetbar met barkrukken. Wijnflessen van een wijngaard in Connecticut die hij bezit, staan ​​in een aantal schappen. Achter de ramen ligt de Long Island Sound. De plaats schreeuwt ik ben uniek . En dat is Rothberg ook. In 1991, tijdens het afronden van zijn doctoraat in de biologie aan de Yale University, startte hij CuraGen, een van de eerste bedrijven die geneesmiddelen ontwikkelde op basis van genomica. Naast CuraGen en 454 Life Sciences heeft hij een instituut opgericht voor de studie van kinderziekten en nog een ander biotechbedrijf, RainDance Technologies, dat zogenaamde vloeibare printplaten heeft ontwikkeld die zijn ontworpen om experimenten efficiënter te maken door kleine hoeveelheden te manipuleren van vloeistof. En dat allemaal op 43-jarige leeftijd.

Het was inderdaad een interesse in de uniciteit van elke persoon die hem er uiteindelijk toe bracht om te proberen een sequencer te ontwerpen waarvan hij hoopt dat die op een dag genoomcontroles zal maken die net zo routinematig zullen zijn als bloedonderzoeken nu zijn. Rothberg houdt de ingewanden van de 454-machine omhoog, een glasplaatje met 1,6 miljoen miniatuurputjes, elk ongeveer 50 micrometer breed (ongeveer de helft van de breedte van een mensenhaar) en 55 micrometer diep. Het is deze chip waarmee de machine DNA zo snel kan sequencen, omdat in elk putje een aparte chemische reactie kan worden uitgevoerd.

Gensequencing maakt gebruik van het feit dat de twee strengen van een DNA-helix complementair zijn: van de vier chemische basen adenine, guanine, thymine en cytosine, die in verschillende volgorden op elke streng aan elkaar zijn geregen, adenineparen alleen met thymine, en guanine alleen met cytosine. In de meest gebruikte sequentietechniek, die voortbouwt op een schema dat 30 jaar geleden is ontwikkeld door Frederick Sanger van de Universiteit van Cambridge, worden DNA-fragmenten gescheiden in enkele strengen en blootgesteld aan vrije nucleotiden, die binden aan de oorspronkelijke As, Cs, Ts, en Gs om nieuwe complementaire strengen te genereren. Deze strengen variëren in lengte omdat sommige van de vrije nucleotiden zijn gemodificeerd om te voorkomen dat de reactie doorgaat; wanneer een van deze basen aan zijn doelwit bindt, stopt de ketting met groeien. En aan elk van deze vier soorten ketenafsluitingen is een andere fluorofoor bevestigd die fluoresceert wanneer ze door een laserstraal wordt geraakt. Een elektrische stroom scheidt de strengen op grootte, en de laser leest de kleuren om te bepalen welke de laatste basis was die aan elke ketting was toegevoegd, waarbij de volgorde wordt beschreven. De overgrote meerderheid van de laboratoria die tegenwoordig aan sequencing doen, gebruiken een machine van Applied Biosystems die ongeveer twee miljoen basen per dag uitspuugt.

De nieuwste sequencer uit 454 kan 300 miljoen per dag lezen.

De 454-methode vermijdt een aantal van de meer tijdrovende stappen van conventionele sequencing, zoals het scheiden van strengen op grootte. In tegenstelling tot Sanger-sequencing beëindigt het geen ketens: het registreert basen wanneer ze aan een groeiende streng worden toegevoegd. Eerst wordt een DNA-molecuul willekeurig in verschillende lengtes gehakt. Vervolgens wordt elk fragment gestript in enkele strengen en wordt elke streng bevestigd aan een afzonderlijk klein kraaltje. Een biochemisch proces kopieert de enkele strengen, zodat 10 miljoen klonen uit elke kraal uitsteken. Elke kraal wordt vervolgens verpakt in een van de 1,6 miljoen putten. As, Cs, Ts en Gs wassen achtereenvolgens over de putjes om nieuwe complementaire strengen te synthetiseren.

Hier is het echt slimme deel: met behulp van een methode die voor het eerst is beschreven door Pål Nyrén en collega's van het Zweedse Royal Institute of Technology, registreert de sequencer van 454 onmiddellijk wanneer een base aan elke streng wordt toegevoegd door gebruik te maken van het feit dat de bindingsreactie een chemische stof vrijgeeft die pyrofosfaat wordt genoemd. In de putten van de 454-machine wordt het pyrofosfaat opgevangen door een chemische cascade die uiteindelijk op het enzym luciferase (dat van nature voorkomt in vuurvliegjes) terechtkomt - een uitbarsting van licht uitzendend. Een standaard ladingsgekoppeld apparaat van het soort dat in digitale camera's en telescopen wordt gebruikt, detecteert elke flits en leest de volgorde van As, Cs, Ts en Gs in elk fragment af. Het proces kan ongeveer 200 tot 300 basen achter elkaar lezen. Net als bij conventionele sequentiebepaling, zoeken computers vervolgens naar overeenkomende sequenties aan het einde van het ene fragment en het begin van een ander, waarbij de fragmenten weer in de juiste volgorde worden samengevoegd.

De sequencer die 454 in oktober 2005 op de markt bracht had een paar serieuze beperkingen. Het kon slechts 100 basen achter elkaar lezen (hoe langer het stuk basen in elk fragment waarvan de sequentie is bepaald, hoe gemakkelijker het is om een ​​volledig genoom samen te stellen), en het had ook moeite om repetitieve stukken nauwkeurig in kaart te brengen, bijvoorbeeld zes As rug aan rug. Maar Rothberg zegt dat de filosofie van 454 was: Haal het er vroeg uit; het geaccepteerd krijgen. Het bedrijf richtte zich eerst op early adopters zoals Broad's Lander, in de hoop dat ze snel bevindingen zouden publiceren die afhankelijk waren van de sequencer. Je moet eerst de vroege jongens krijgen, maar de rest van de jongens, de volgers, zijn waar de markt is, zegt Rothberg. En ze lazen peer-reviewed papers.

Neanderthalers
Een artikel van een early adopter dat veel aandacht kreeg van zowel wetenschappers als het publiek, was een onderzoek naar Neanderthaler-DNA onder leiding van Svante Pääbo van het Max Planck Instituut voor Evolutionaire Antropologie in Leipzig, Duitsland. Neanderthalers, de soort die het dichtst bij de moderne mens staat, verdwenen zo'n 30.000 jaar geleden, en er wordt meer gespeculeerd dan feit over hun genetische relatie met ons. Hoewel Pääbo enkele eerdere onderzoeken met Neanderthaler-DNA had gedaan, was alles wat verder ging dan rudimentaire analyse te moeilijk en kostbaar gebleken. Het probleem is dat in de loop van duizenden jaren de weinige bekende monsters van Neanderthaler-DNA uit fossielen zijn afgebroken tot korte fragmenten van ongeveer 50 tot 75 basenparen. Bovendien is het DNA vaak besmet met genetisch materiaal van micro-organismen en de moderne mens die de fossielen heeft gehanteerd. Maar Rothberg geloofde dat de 454-machine veel korte reeksen kon analyseren tegen weinig kosten, en voldoende informatie zou genereren om wetenschappers oude schatten van rommel te laten scheiden. Rothberg noemde Pääbo koud, die ermee instemde om samen te werken.

Na het sequencen van genen van 70 Neanderthaler bot- en tandmonsters, vonden Pääbo's team en onderzoekers van 454 één monster, naar schatting 38.000 jaar oud, dat grotendeels schoon DNA bevatte. Zoals ze meldden in een paper dat afgelopen herfst is gepubliceerd Natuur , hebben ze vervolgens een miljoen basenparen gesequenced uit minder dan 200 milligram materiaal, een prestatie die aanwijzingen heeft opgeleverd over de vraag of moderne mensen en Neanderthalers kruisten en wanneer de twee soorten van elkaar afweken. Belangrijker is dat het artikel laat zien dat het sequentiëren van alle drie miljard basen in het Neanderthaler-genoom haalbaar is. Dit zou kunnen helpen bij het oplossen van mysteries zoals of Neanderthalers het genetische vermogen hadden om te spreken.

Uitzoeken of mensen en Neanderthalers gekruist zijn of zelfs met elkaar kunnen praten, krijgt misschien veel pers en publieke aandacht, maar andere toepassingen voor ultrasnelle DNA-sequencing kunnen een veel grotere impact hebben op de geneeskunde en op ons leven. De traditionele sequentiemethode kijkt naar DNA van veel verschillende cellen. Maar als een van die cellen bijvoorbeeld een tumorcel is, kan de volgorde ervan iets afwijken van die van de gezonde cellen. In dergelijke gevallen selecteren de computers de reeks die het vaakst wordt gevonden en negeren de andere. Sequencers van de volgende generatie, zoals degene die op de markt worden gebracht door 454, klonen en sequencen in plaats daarvan enkele DNA-moleculen, waardoor ultradiep onderzoek mogelijk wordt om zeldzame varianten op te sporen. (Traditionele sequencers kunnen ook afzonderlijke moleculen analyseren, maar dat is onbetaalbaar.) De implicaties van single-molecule sequencing zijn enorm voor de geneeskunde. Hoewel het niet praktisch is om conventionele sequencing te gebruiken om de DNA-verschillen tussen gezonde en zieke cellen op te sporen, kunnen de nieuwe machines dergelijke experimenten gemakkelijk uitvoeren.

Matthew Meyerson, een klinisch patholoog aan het Dana-Farber Cancer Institute in Boston, heeft een studie gepubliceerd die laat zien hoe de 454-machine kan helpen bij het ontdekken van mutaties die verband houden met longkanker. Longkankermedicijnen die nu beschikbaar zijn, richten zich op het gen dat Meyerson aan het sequentiëren is, en hij hoopt dat artsen uiteindelijk beter kunnen bepalen wie op welke medicijnen zal reageren door te weten te komen of de patiënt een bepaalde mutatie heeft. Ik stel me voor dat over een paar jaar alle kankerpatiënten hun tumoren zullen hebben die worden gekenmerkt door single-molecule sequencing als de technologie blijft dalen in kosten, zegt hij.

In een variatie op dit thema heeft Michael Kozal, een aids-arts in Yale, zich aangesloten bij 454 om ultradiepe sequencing van hiv uit te voeren om de aanwezigheid van kleine populaties van het medicijnresistente virus te bepalen. Vroege tests van de techniek bij patiënten ontdekten ongeveer twee keer zoveel resistente HIV als Sanger-sequencing. Ook deze informatie zou artsen kunnen helpen bij het individualiseren van behandelingsregimes, wat de kosteneffectiviteit zou verhogen. Het is praktisch om te doen in ons systeem, zegt 454 hoofdwetenschapper Michael Egholm, die samenwerkt met Kozal. Vroeger was het gewoon niet betaalbaar.

Mijn genoom
George Church, een pionier op het gebied van sequencing aan de Harvard Medical School, zegt dat kosten de sleutel zijn. Naarmate hun prijzen de komende jaren dalen, zegt hij, zullen deze machines een democratiserende kracht worden die traditionele sequencers vrijwel overbodig zal maken, net zoals personal computers mainframes verdrongen. En dat leidt tot toepassingen die nog niemand kan doorgronden. Als we nog steeds met mainframes zouden werken, zouden er niet veel coole dingen gebeuren, zegt hij.

Church, een van de tientallen onderzoekers die halverwege de jaren tachtig het Human Genome Project voorstelden, is een van de weinige biologen wiens laboratoriumapparatuur een op een tafel gemonteerde bankschroef en een kolomboormachine omvat. Hij gebruikt dergelijke apparatuur om zijn eigen next-generation sequencers te bouwen, waarvan zijn lab er momenteel acht heeft (zie TR35 , september/oktober 2006 ) . Ervan overtuigd dat bedrijven te veel vragen voor hun machines, maakt hij er een punt van om zijn knowhow vrijelijk te delen met geïnteresseerde collega's. Hij vergelijkt zijn filosofie met de wiki- en Linux-mentaliteit en zegt: als een stel mieren bij elkaar komt, kunnen ze een rubberboomplant verplaatsen.

De grootse visie van Church is om de goedkope stroom van As, Cs, Ts en Gs te kanaliseren in wat hij het Personal Genome Project noemt. In het Human Genome Project hebben onderzoekers DNA verkregen van meerdere personen, die om privacyredenen elk anoniem blijven. Dus de laatste reeks vertegenwoordigt een samengestelde persoon met een conglomeraat van verschillende genetische achtergronden en medische geschiedenissen. Church wil dat zijn Personal Genome Project het DNA van individuen ontcijfert, die ook vrijwillig hun medische dossiers zullen verstrekken. Hij zal alle resulterende gegevens op internet plaatsen. Uiteindelijk, zo denkt hij, zullen miljoenen mensen zich bij het project aansluiten en hun sequenties, medische dossiers en, als ze dat willen, zelfs gezichtsfoto's online plaatsen. De hele wereld heeft dan toegang tot alle gegevens die nodig zijn om hypothesen vrijelijk te testen.

Hoewel de kerk aanzienlijke financiering heeft ontvangen van de National Institutes of Health om sequencing-technologie te ontwikkelen, hebben de ethische, juridische en sociale vragen die door het persoonlijke Genome Project worden gesteld, de NIH ervan weerhouden het te ondersteunen, ondanks een positieve beoordeling van een subsidieaanvraag in augustus 2005. Zodra ik goedkeuring kreeg, raakte NIH helemaal opgewonden, en niet per se op een goede manier, zegt hij. Hij heeft geprobeerd de privacy- en vertrouwelijkheidskwesties aan te pakken, waarbij hij opmerkt dat niemands identiteit openbaar hoeft te worden gemaakt en dat de NIH al projecten voor menselijke genetica financiert die minder waarborgen bieden.

De kerk erkent dat een grondige kennis van hun eigen DNA voor veel mensen misschien te veel is. Je laat je kinderen niet naar pornosites op internet surfen, zegt hij, en tot op zekere hoogte sta je jezelf niet toe om door de engste, grofste sites te bladeren. Hij verwacht dat mensen, in plaats van toegang te krijgen tot hun onbewerkte genomen, professionals zullen hebben die hen helpen de informatie te interpreteren.

Ondanks het gebrek aan federale financiering en de ethische bezwaren, gaat de kerk door, ervan overtuigd dat vooruitgang in sequencing-technologie het idee van een persoonlijk genoomproject vooruit zal helpen - net zoals vooruitgang in informatietechnologie ertoe heeft geleid dat vreemden gegevens delen op manieren die niemand had durven dromen van toen de dual-floppy-drive Apple II 30 jaar geleden debuteerde. Naarmate sequencers efficiënter worden, denkt hij, en de kosten blijven dalen, zal persoonlijke genomica een grote vlucht nemen op een schaal die maar weinig mensen zich ooit hebben voorgesteld.

De loterij winnen
Afgelopen oktober kondigde de X Prize Foundation een prijs van 10 miljoen dollar aan voor het produceren van zeer nauwkeurige sequenties van 100 menselijke genomen in 10 dagen of minder zonder meer dan 10.000 dollar per genoom uit te geven. Een van de eerste deelnemers was 454, dat van plan is nog kleinere kralen te ontwikkelen waarvan hij hoopt dat zijn machines nog meer DNA per run kunnen lezen tegen ongeveer dezelfde kosten. We hebben geen nieuwe natuurkunde of wiskunde nodig om bij het genoom van $ 1.000 te komen, zegt Rothberg.

Afgezien van de vraag wanneer - of als - iemand de X-prijs zal claimen, zal DNA-sequencing zeker in prijs blijven dalen en in nauwkeurigheid toenemen. Tot vorig jaar worstelde sequencing echt om de impact te hebben op het volgende tijdperk van genomics dat het nodig had, zegt David Bentley, hoofdwetenschapper van Illumina. Kortom, de prijs van traditionele sequencing daalde gewoon niet snel genoeg. Nu is het veld veel optimistischer dan het was, zegt hij. Sequencing van de volgende generatie speelt een grote rol.

Wetenschappers de mogelijkheden horen afvinken is als luisteren naar loterijwinnaars. En gepersonaliseerde geneeskunde, zoals het type kankeronderzoek en -behandeling dat Dana-Farber's Meyerson hoopt te helpen inluiden, is slechts een startpunt. Bentley zegt dat de nieuwe sequencers vensters zullen openen op de uitgestrekte niet-coderende gebieden van het genoom die genen aan- en uitzetten. Egholm van 454 merkt op dat het Human Genome Project niet elk laatste stukje menselijk DNA heeft gesequenced; er kunnen nog onontdekte genen zijn die aanvullende sequencing kan vinden. Broad's Lander stelt zich een stortvloed aan nieuwe informatie voor over wat een cel ertoe brengt om te differentiëren in een of ander type (een centraal mysterie in de ontwikkelingsbiologie) en wat verschillende cellulaire toestanden regelt. Ik realiseer me dat dat moeilijker uit te leggen is dan kanker genezen, zegt hij, maar het is uiteindelijk belangrijker, omdat het alle ziekten zal treffen.

Binnen het komende jaar, zo voorspelt Lander, zullen wetenschappers kunnen beginnen met onderzoeken die terabases aan informatie genereren: een biljoen As, Cs, Ts en Gs. Ik heb het woord niet eens gesproken terabase voor vorig jaar, zegt hij. En als al die gegevens op het web staan ​​en vrij beschikbaar zijn, zal dat een heel ander soort biologie stimuleren.

Jon Cohen, een freelance schrijver en correspondent uit San Diego voor Wetenschap , werkt aan een boek dat kijkt naar de genetische verschillen die chimpansees van mensen scheiden.

zich verstoppen