Sequentiebepaling van een enkel molecuul DNA

In de hoek van het kantoor van Helicos BioSciences in Cambridge, MA, flitst een scherm op het gezicht van wat lijkt op een gigantische koelkast een aftelling: 10 dagen, vijf uur en 51 minuten totdat het klaar is met het lezen van de volgorde van al het DNA dat is erin gevoerd. De machine met hoge doorvoer, een complexe configuratie van buizen, lasers en chemicaliën, bevat twee platen, elk met 25 microfluïdische kanalen erin geëtst. Elk kanaal kan een afzonderlijk DNA-monster vasthouden en sequencen. Door de monsters parallel te rangschikken, heeft de machine slechts een uur nodig om 1,3 miljard van de chemische basen - bekend als A, C, T en G - te lezen die een DNA-streng vormen.

De HeliScope is de eerste commerciële machine die een enkel stuk DNA sequentiëert in plaats van één stuk dat vele malen is gekopieerd. Elke stroomcel (hierboven) heeft 25 kanalen, die elk 16 miljoen DNA-strengen kunnen bevatten voor sequencing. Een coating op het oppervlak van de cel maakt het mogelijk om deze tussen de reacties schoon te wassen.

Het wordt de HeliScope genoemd en is het eerste commerciële instrument dat direct de volgorde van een enkele dergelijke streng kan lezen, een vermogen dat het potentieel geeft voor ongekende snelheid. Sterker nog, zegt Stephen Quake, een bio-ingenieur aan de Stanford University die het bedrijf in 2003 mede oprichtte, heeft Helicos in feite 's werelds snelste DNA-sequencer gebouwd. Hoewel het niet duidelijk is of de machine sneller een complete sequentie zal produceren dan concurrerende systemen (de gegevens die door een sequencing-machine worden gegenereerd, moeten nog worden geanalyseerd en aan elkaar worden genaaid, een rekenintensieve taak), zegt Quake dat het hele nieuwe gebieden van Onderzoek.

Dit verhaal maakte deel uit van ons nummer van juli 2008

• Zie de rest van het nummer
• Abonneren

De HeliScope, eerder dit jaar geïntroduceerd, doet mee aan een intense race voor snellere en goedkopere sequencing-technologieën. De prijs voor het sequencen van een menselijk genoom is de afgelopen jaren gedaald, van de $ 300 miljoen die het Human Genome Project aan zijn eerste ontwerp heeft uitgegeven tot minder dan $ 100.000. De toepassingen van goedkope sequencing zijn bijna onbeperkt, van ziektediagnostiek tot onderzoek dat microben zou kunnen opleveren die zijn ontwikkeld om biobrandstoffen of medicijnen te produceren.

In andere geavanceerde sequencing-technologieën die momenteel in gebruik zijn, waaronder die van Illumina, Applied Biosystems en 454 Life Sciences (die vorig jaar door Roche werd overgenomen), moet het DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, vele malen worden geamplificeerd of gekopieerd; de kopieën worden vervolgens gelijktijdig gelezen om het gemakkelijker te maken om fluorescente signalen te detecteren die de positie van elke DNA-letter aangeven. Sequentiebepaling van één molecuul slaat de kopieerstap over, wat betekent dat er veel meer unieke monsters in een enkel sequentiëringsexperiment kunnen worden verpakt.

multimedia

• Bekijk het proces van Helicos Biosciences voor het sequencen van een enkel DNA-molecuul.

• Stephen Quake, medeoprichter van Helicos Biosciences, vertelt over sequencing.

Bovendien kan sequencing met één molecuul mogelijk een vollediger beeld van het genoom genereren. Dat komt omdat wanneer DNA wordt geamplificeerd, sommige strings waarschijnlijker zijn dan andere om met succes te worden gekopieerd, dus het is waarschijnlijker dat ze in de uiteindelijke reeks worden weergegeven. Evenzo kunnen zeldzame genetische mutaties niet worden weergegeven omdat ze niet worden gekopieerd. Als je aan het eind van de dag gewoon een enkele DNA-streng op een platform kunt plaatsen en het direct kunt sequencen, is dat een enorm voordeel, zegt Elaine R. Mardis, mededirecteur van het Genome Center van de Washington University in St. Louis.

's Nachts wakker
Met de Helicos-technologie wordt het DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, eerst in korte stukjes van ongeveer 200 basen lang gehakt en in een stroomcel, een gespecialiseerd glasplaatje, geïnjecteerd. De stroomcel is bedekt met kleine stukjes DNA die zijn ontworpen om de fragmenten vast te houden terwijl ze voorbij drijven, en ze op hun plaats te verankeren. De geïmmobiliseerde stukjes DNA worden fluorescerend gelabeld zodat hun positie onder een fluorescentiemicroscoop door een camera kan worden vastgelegd. Bijna een miljard stukjes DNA kunnen worden geanalyseerd in een enkel sequentie-experiment, vergeleken met ongeveer 400.000 tot 50 miljoen voor andere technologieën.

De stroomcel wordt vervolgens in de HeliScope genesteld, waar de microscoop zich genesteld bevindt in 400 pond Vermont-graniet. Het toegevoegde gewicht voorkomt dat trillingen de signalen die het apparaat moet detecteren verstoren. Een complex optisch systeem en een wirwar van buizen omringen de microscoop en verbinden deze met wat lijkt op een miniatuurkoelkast gevuld met flessen speciaal gemaakte chemicaliën.

Wanneer een wetenschapper de machine activeert, begint een nauwkeurig gechoreografeerde dans van vloeistoffen. Een enzym genaamd DNA-polymerase en een enkel type fluorescerend gelabelde base, bijvoorbeeld A, stromen de cel in. Het enzym zorgt ervoor dat die As hun plaats innemen in groeiende DNA-strengen die de strengen in de monsters aanvullen. (Elk van de vier basen kan paren met slechts één andere base, dus een toegevoegde A moet tegenover een bestaande T staan ​​en een C tegen een G.) Zodra de fluorescerend gelabelde base in de nieuwe streng is opgenomen, kan de camera van de HeliScope spot het licht dat het uitstraalt. De imager detecteert een pluim - een lichtkegel van 200 nanometer - van de integratie van een enkele [base] op een enkele DNA-streng, zegt Steve Lombardi, president van Helicos.

Andere geavanceerde sequencing-methoden gebruiken een vergelijkbare benadering, bekend als sequencing door synthese. Maar in tegenstelling tot die technologieën kan de HeliScope het niet-versterkte fluorescentiesignaal onderscheiden van een enkele base die zijn plaats inneemt op een groeiende DNA-streng. Een sleutel tot dat vermogen is een anti-aanbakmateriaal dat het bedrijf heeft ontwikkeld, dat het oppervlak van de stroomcel bedekt en ervoor zorgt dat het tussen de reacties door schoon kan worden gewassen: resterende fluorescerende basen zouden het moeilijker maken om individuele sequentiereacties nauwkeurig te detecteren. Je moet ervoor zorgen dat er geen extra base-moleculen aan het oppervlak blijven kleven, zegt Patrice Milos, hoofd wetenschappelijk directeur bij Helicos. Dit was een van de grootste vroege uitdagingen. Na elke cyclus worden de fluorescerende markers van de nieuw opgenomen basen geknipt en worden de resterende chemicaliën weggespoeld. Het proces wordt achtereenvolgens herhaald met elk van de vier basen.

De HeliScope genereert elke seconde een enorme hoeveelheid onbewerkte gegevens. Het duurt vijf tot tien dagen om al het DNA te lezen dat in twee stroomcellen kan worden geladen; voor sequencing zijn dat 400 miljoen DNA-strengen per cel, die een bruikbare sequentie van 20 miljard basen kunnen genereren. Wetenschappers laden de machine, drukken op een knop op de voorkant en vertrekken. Maar de geobsedeerde sequencing kan internet gebruiken om de voortgang van de machine midden in de nacht te controleren, een veel voorkomend verschijnsel bij Helicos.

Zodra de HeliScope zijn serie fluorescentiefoto's heeft gemaakt, zet een bijbehorend gegevensverwerkingscentrum ze om in reeksen letters. Software plakt deze stukjes aan elkaar om een ​​langere reeks te vormen.

Ontbrekende mutaties
In een paper gepubliceerd in Wetenschap eerder dit jaar rapporteerden wetenschappers over hun gebruik van de HeliScope om het genoom van het M13-virus te sequensen, belangrijk bewijs dat single-molecule sequencing zou kunnen worden gebruikt om de sequentie van een compleet genoom te lezen en samen te stellen. (Ongeveer 7.000 basenparen lang, het genoom van het M13-virus is klein - ongeveer een miljoenste van de grootte van een mens.) De technologie is zo nieuw dat het nog niet duidelijk is voor welke toepassingen het het meest geschikt zal zijn. Maar sommige wetenschappers zijn van mening dat sequencing van één molecuul bijzonder belangrijk kan zijn om te begrijpen hoe genetische variaties bijdragen aan ziekte. Immers, sommige zeldzame mutaties die verband houden met ziekte zijn mogelijk over het hoofd gezien in eerdere genomische onderzoeken omdat ze niet zijn gekopieerd tijdens het amplificatieproces.

Helicos sleutelt nog steeds aan de technologie en ontwikkelt chemie die de snelheid van de sequentiereacties kan verhogen en het mogelijk maakt dat meer stukjes DNA aan een stroomcel worden verankerd. Samen met de andere grote spelers in het veld hoopt het bedrijf een volledige genoomsequentie te leveren voor $ 1.000, een prestatie die het begin zou betekenen van iets totaal nieuws in de geneeskunde: het vermogen van individuen om toegang te krijgen tot hun eigen genoominformatie.

Emily Singer is KINDEREN ’s biotechnologie en life sciences redacteur.

zich verstoppen